Un método rápido y económico basado en amplicones para la secuenciación masiva del genoma completo del virus de la anemia infecciosa aviar

Resumen

El virus de la anemia infecciosa aviar (CAV) causa graves problemas sanitarios y considerables pérdidas económicas en la industria avícola mundial. Provoca una enfermedad inmunosupresora conocida como anemia infecciosa, que reduce los parámetros productivos al incrementar la incidencia de otras enfermedades, disminuir la eficiencia en la conversión alimenticia de las aves y generar una respuesta subóptima a las vacunas. CAV posee un genoma de ADN simple hebra circular de polaridad negativa de aproximadamente 2,3 Kb y se clasifica en tres o cuatro genotipos o clados en base a la región hipervariable de la proteína de la cápside (hvVP1). Para una caracterización más completa de las cepas circulantes es necesario secuenciar los genomas completos de CAV. El objetivo de este estudio fue desarrollar y estandarizar un protocolo de amplicones en mosaico, combinado con secuenciación masiva, para obtener de manera directa y económica las secuencias completas de los genomas de CAV. Se diseñaron cebadores para amplificar regiones de 200 a 300 pb, a los cuales se les añadió la secuencia del adaptador de Illumina en el extremo 5'. Los amplicones se superponen parcialmente para reconstruir la secuencia completa de los genomas de CAV. Este método no solo reduce costos, sino que también agiliza la preparación de las librerías de secuenciación. Para evitar la amplificación de regiones solapadas, los cebadores se dividieron en dos pools (pool 1 y pool 2), y un juego de cebadores se mantuvo independiente. La cepa vacunal Nobilis P4 se utilizó para estandarizar las reacciones de singleplex y las dos multiplex-PCR. Los productos resultantes de estas PCR fueron combinados, indexados y secuenciados utilizando un equipo MiniSeq de Illumina. Tras la estandarización, este método se aplicó a ocho cepas de campo uruguayas y ocho argentinas y se obtuvieron secuencias genómicas completas de todas ellas. Los análisis demostraron que ninguna cepa era recombinante y que se agrupaban en dos de los clados descritos para CAV. El método presentado aquí es robusto, rápido y económico. Además, proporciona un conocimiento profundo de las características genéticas y evolutivas de este virus, ya que permite además la detección de eventos de coinfección en el campo. Esperamos que esta metodología contribuya a la vigilancia genómica de CAV y proporcione información relevante para el sector avícola.