Último Número: 206 Abril-Junio 2017

Científico: Estudio del polimorfismo de los genes GH e IGF-1 en vacas Holando en Uruguay

Scientific: Study of GH and IGF-1 genes’ polymorphism in Holstein cows in Uruguay


Autores: Ruprechter G1*, Nicolini P1, Carriquiry M2., Meikle A1, Armstrong E,.

1Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria, Universidad de la República, Lasplaces 1620, Montevideo, Uruguay.

2Departamento de Producción Animal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República, Uruguay.

3Área Genética, Depto. Genética y Mejora Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de la República, Uruguay.

*Autor para correspondencia. Correo electrónico: Esta dirección electrónica esta protegida contra spambots. Es necesario activar Javascript para visualizarla

Recibido: 21/2/2014 Aceptado: 7/4/2014


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Introducción | Materiales y Métodos | Resultados y Discución | Conclusión | Agradecimientos | Bibliografía

Resumen

En este trabajo se determinaron frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos AluI y SnabI de los genes que codifican para hormona de crecimiento (GH) y factor de crecimiento similar a la insulina tipo I (IGF-I) en 308 vacas Holando de cuatro rodeos del Uruguay. El alelo L del gen GH presentó la mayor frecuencia en los tres tambos analizados (0,821, 0,853 y 0,947), mientras que el alelo V se encontró en muy baja frecuencia (0,179, 0,147 y 0,053) en los tambos 1, 2 y 4, respectivamente, determinando la mayor frecuencia para el genotipo LL. El gen IGF-I presentó una distribución más equitativa de alelos: alelo A = 0,609, 0,592, 0,554 y 0,547 y alelo B = 0,391, 0,408, 0,446 y 0,453 para los tambos 1, 2, 3 y 4, respectivamente. Se obtuvieron índices bajos o medios de heterocigosidad (Ho mínima = 0,105 para GH en el tambo 4; Ho máxima = 0,554 para IGF-I en la misma población). Los índices FIS fueron bajos a medios, no detectándose desviaciones del equilibrio Hardy-Weinberg. Los valores FST globales fueron cercanos a cero (FST < 0,009) argumentando a favor de similitud génica entre las poblaciones, siendo las más distantes entre sí las de los tambos 1 y 4 con un FST de 0,022.

Palabras clave: polimorfismos - GH-IGF-I - vacas Holando.


Summary

In this study, 308 cows were genotyped for AluI (GH) and SnabI (IGF-I) polymorphisms and allelic and genotypic frequencies were determined in Holstein cows from four farms of Uruguay. For the GH gene, the L allele was the most frequent in the three dairies sampled (0.821, 0.853 and 0.947), while the V allele was found in low or very low frequency in farms 1, 2 and 4 (0.179, 0.147 and 0.053), leading to a high frequency of the LL genotype. The IGF-I gene showed a more balanced distribution of alleles: allele A = 0.609, 0.592, 0.554 and 0.547; allele B = 0.391, 0.408, 0.446 and 0.453, for farms 1, 2, 3 and 4, respectively. Low and moderate values of heterozygosis were obtained (minimum value Ho = 0.105 for GH in farm 4; maximum value Ho = 0.554 for IGF-I in the same population). In addition, FIS values were low to moderate and no deviations from Hardy-Weinberg equilibrium were detected. Global FST values ​​were very close to zero (FST < 0.009) arguing in favor of observed genetic similarity between populations, being farm 1 and 4 the most distant populations with a FST 0.022.

Key words: polymorphism - GH-IGF-I - Holstein cows.


Introducción

Uno de los genes más estudiados en producción lechera es el que codifica para la hormona de crecimiento (GH), ya que es conocido su rol en el desarrollo mamario, lactación y regulación del metabolismo (Etherton y Bauman, 1998). Cambios en la secuencia de ADN del gen pueden provocar cambios en la acción hormonal que resulte en diferentes comportamientos productivos. Se ha identificado una variante de este gen: el polimorfismo C/G, que es detectado por la enzima AluI (Lucy y col., 1993). Este polimorfismo implica un cambio en la codificación del aminoácido leucina (Leu127 alelo L) por valina (Val127 alelo V) en la posición 127 de la molécula de GH (Lucy y col., 1993). La información en relación a la asociación de este polimorfismo con producción/composición de leche es contradictoria. Varios autores han documentado asociaciones positivas (Grochowska y col., 2001; Lucy y col., 1993; Shariflou y col., 2000; Zwierzchowski y col., 2002), mientras que en otros trabajos no se encontró asociación ( Balogh y col., 2009; Ruprechter y col., 2011;Yao y col., 1996).

Por otro lado, y en menor grado, se han investigado marcadores moleculares en el gen que codifica para el factor de crecimiento similar a insulina tipo I (IGF-I) por ser el mediador de la acción de la GH en varios tejidos, incluyendo la glándula mamaria (Schoenle y col., 1982). En este sentido, fue reportado un polimorfismo T/C detectado por SnabI en la región promotora del gen bovino IGF-I, siendo el nucleótido T correspondiente al alelo A y el C al alelo B. Los reportes sobre el efecto de este polimorfismo en la producción y composición de leche también son contradictorios: se han encontrado asociaciones positivas (Ruprechter y col., 2011; Siadkowska y col., 2006) o no se encontró asociación (Hines y col., 1998; Mullen y col., 2011), entre este polimorfismo y variables productivas.

Un paso fundamental para realizar estudios de asociación de polimorfismos con características de importancia productiva es describir las frecuencias génicas y genotípicas y analizar la variabilidad del polimorfismo de interés en las poblaciones a estudiar. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos AluI (GH) y SnabI (IGF-I), analizando su variabilidad en vacas Holando de cuatro tambos de Uruguay.

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Materiales y Métodos

Se extrajeron al azar muestras de sangre (n = 308) de vacas Holando (Uruguay) clínicamente sanas en tubos BD Vacutainer® (Becton Dickinson, NJ, USA) con anticoagulante (K2 EDTA), por venopunción coccígea. Las vacas provenían de cuatro tambos: 1 (n = 110), 2 (n = 76) 3 (n = 46) y 4 (n = 76), con una población total de 700, 450, 200 y 110 vacas en ordeñe, respectivamente. Los criterios de selección para la compra del semen en cada tambo y su procedencia (nacional o importado) fueron registrados (Cuadro 1).

Cuadro 1. Número de vacas en ordeñe (vacas muestreadas), origen del semen y criterios de selección de cada rodeo

Tambo

Vacas totales

Origen del semen

Criterios de selección del semen

(Vacas muestreadas)

1

700 (110)

Nacional (Uruguay)

Sólidos totales

Canadiense

+ en ubre

Estadounidense

2

450 (76)

Neocelandés

Sólidos totales

Bajo tamaño corporal

+ en ubre y patas

Fertilidad

Longevidad

3

200 (46)

Estadounidense

+ en proteína

Facilidad de parto

Menor tamaño

4

110 (76)

Canadiense

Facilidad de parto

Estadounidense

Precio

Las muestras de sangre fueron almacenadas a 4 °C hasta su procesamiento, realizándose la extracción de ADN según el protocolo de Kawasaki (1990). La determinación de los polimorfismos AluI del gen GH y SnaBI del gen IGF-I se realizó por PCR-RFLP según Lucy y col. (1993) y Ge y col. (1997), respectivamente. Brevemente, se amplificó un fragmento del gen GH de 427 pares de bases (pb) utilizando los cebadores: 5’-CCGTGTCTATGAGAAGC-3’ (sentido) y 5’-TTCTTGAGCAGCGCGT-3’ (antisentido). La reacción de PCR se realizó en un volumen final de 30 uL conteniendo aproximadamente 100 ng de ADN genómico, 18 pmol de cada cebador, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM de MgCl2 y 0,5 U de Taq polimerasa (Invitrogen Life Technologies, CA, USA). Dicho PCR se llevó a cabo en un termociclador Multigene (Labnet Internacional Inc., NJ, USA) y las condiciones de amplificación fueron: 8 min a 95 ºC y 32 ciclos de 35 seg a 95 ºC, 1 min a 60 ºC y 45 seg a 72 ºC. Posteriormente, se digirió el producto amplificado (15 μL) por 3,5 h a 37 ºC con 6 U de AluI (Fermentas Inc., MD, USA). La separación de los fragmentos de restricción se realizó en gel de agarosa al 2 % con tinción de bromuro de etidio (EtBr) y su visualización se realizó en un transiluminador UV (Cleaver Scientific, Inglaterra). Para el gen IGF-I se amplificó un fragmento de 249 pb utilizando los cebadores: 5’-ATTACAAAGCTGCCTGCCCC-3’ (sentido) y 5’-ACCTTACCCGTATGAAAGGAATATACGT-3’ (antisentido). La reacción de PCR se realizó en un volumen final de 10 uL conteniendo aproximadamente 100 ng de ADN genómico, 0,30 uM de cada cebador, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM de MgCl2 y 0,8 U de Taq polimerasa (Invitrogen). La reacción de PCR se llevo a cabo en el termociclador Multigene y el perfil de amplificación fue: 31 ciclos de 94 ºC 1 min, 64 ºC 1 min y 72 ºC 1 min. Posteriormente se digirió el producto amplificado (10 μL) por 3 h a 37 ºC con 5 U de SnabI (Fermentas Inc.). La separación de los fragmentos de restricción se realizó en gel de agarosa al 3% con tinción de EtBr y su visualización se realizó en un transiluminador UV (Cleaver Scientific).

Para cada gen se calcularon las frecuencias alélicas y genotípicas, se realizaron pruebas de equilibrio Hardy-Weinberg y de diferenciación génica y genotípica, se calculó la heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He) y los índices de fijación o estadísticos F (FIS y FST, Weir y Cockerham, 1984) utilizando el programa Genepop v4 (Rousset, 2008). Se realizó un análisis de desequilibrio gamético mediante el programa Haploview 4.2 (Barrett y col., 2005). Se consideró α ≤ 0,05 como nivel de significancia. Debido a problemas de calidad de la reacción de PCR (presencia de una banda inespecífica) para el gen GH en las muestras del tambo 3, éste no fue considerado para el análisis estadístico.

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Resultados y Discusión

En el presente trabajo se determinó, para cuatro tambos de vacas Holando del Uruguay, las frecuencias alélicas y genotípicas, así como la variabilidad de los polimorfismos AluI y SnabI de los genes GH e IGF-I, respectivamente, del eje somatotrófico, responsables de la partición de nutrientes para producción de leche (Etherton y Bauman, 1998). El análisis poblacional de los polimorfismos es un paso previo fundamental para realizar posteriores estudios de asociación de polimorfismos con características de importancia productiva en las poblaciones de interés.

Para el gen GH, los tres tambos analizados revelan que el alelo de mayor frecuencia fue el L mientras que el alelo V se encontró en muy baja frecuencia. Esto origina una mayor frecuencia del homocigoto LL seguido por el heterocigoto LV, mientras que el homocigoto VV fue de escasa o nula frecuencia (Cuadro 2).

Cuadro 2. Frecuencias alélicas y genotípicas de los marcadores AluI (GH) e SnabI (IGF-I) en los 4 tambos

Marcador

Tambo

Animales

Frecuencia alélica

Frecuencia genotípica

 

 

GH

L

V

LL

LV

VV

1

109

0,821

0,179

0,669a

0,302

0,027

2

68

0,853

0,147

0,720x

0,264

0,014

 

4

76

0,947

0,053

0,894b, y

0,105

0,000

IGF-I

A

B

AA

AB

BB

1

110

0,609

0,391

0,345

0,527

0,127

2

76

0,592

0,408

0,328

0,526

0,144

3

46

0,554

0,446

0,347

0,413

0,239

 

4

74

0,547

0,453

0,270

0,554

0,175

a, b difieren con P = 0,001. x, y difieren con P = 0,066.

 

Las frecuencias genotípicas difirieron entre tambos (P = 0,005), ya que la frecuencia del homocigoto LL del tambo 4 fue significativamente mayor que la del tambo 1 (0,894 vs. 0,669; P = 0,001) y mostró una tendencia a ser mayor que la del 2(0,894 vs. 0,720; P = 0,066). Sin embargo, los tambos 1 y 2 no presentaron diferenciación genotípica. Estos resultados determinaron muy bajos índices de heterocigosidad en el tambo 4 y bajos a medios en los tambos 1 y 2 (Cuadro 3).

 

Cuadro 3. Heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He) para los 2 marcadores analizados en los 4 tambos

Marcador

Tambo

Ho

He

AluI (GH)

1

0,302

0,295

2

0,264

0,252

 

4

0,105

0,100

SnabI (IGF-I)

1

0,527

0,478

2

0,526

0,486

3

0,413

0,500

 

4

0,554

0,498

Los índices FIS negativos indicarían una leve tendencia hacia el exceso de heterocigotas para este gen en las tres poblaciones analizadas, sin que eso genere desviaciones de lo esperado para el equilibrio Hardy-Weinberg (Cuadro 4).

Cuadro 4. Pruebas de equilibrio Hardy-Weinberg para los polimorfismos AluI (GH) y SnabI (IGF-I) en cuatro tambos lecheros del Uruguay. Se muestran los resultados (p-valor y error estándar: e.e) correspondientes a cada una de las pruebas estadísticas realizadas:prueba U para deficiencia de heterocigotas y prueba de probabiidad, con 5000 iteraciones en cada caso. Se consideró α=0.05 como nivel de significación estadística

Prueba estadística

Polimorfismo

Déficit de heterocigotas

Prueba de probabilidad

por población

p-valor

e.e.

p-valor

e.e.

AluI (GH)

1

0.7087

0.0036

1.0000

(-)

2

0.8043

0.0021

1.0000

(-)

4

1.0000

0.0000

1.0000

(-)

SnabI (IGF-I)

1

0.9026

0.0045

0.3196

(-)

2

0.8363

0.005

0.4868

(-)

3

0.1925

0.0034

0.3682

(-)

4

0.8871

0.0039

0.3578

(-)

Los índices FST son bajos y reflejan la mayor diferencia en las frecuencias alélicas entre los tambos 1 y 4 así como entre los tambos 2 y 4. (Cuadro 5).

Cuadro 5. Matrices de estadísticos FIS y FST de los tambos analizados (FIS en la diagonal, en negrita) para cada locus y para todos los loci (Global)

AluI (GH)

1

2

4

1

-0.025

2

-0.002

-0.047

4

0.064

0.043

-0.049

SnabI (IGF-I)

1

2

3

4

1

-0.102

2

-0.004

-0.083

3

-0.001

-0.006

0.174

4

0.022

0.001

-0.008

-0.111

Global

1

2

3

4

1

-0.073

2

-0.003

-0.071

3

-0.001

-0.006

0.174

4

0.022

0.009

-0.008

-0.111

Para el gen GH, existen varios reportes internacionales, en sistemas de producción basados en estabulación y alimentación con raciones totalmente mezcladas (TMR), que documentan la asociación positiva entre el genotipo LL y producción y/o composición de leche y/o mérito genético para producción de leche (Furu y col., 1998; Lucy y col., 1993; Shariflou y col., 2000). Asimismo, en un trabajo previo realizado por nuestro grupo de investigación (Ruprechter y col., 2011), que tuvo como objetivo iniciar estudios de asociación de estos marcadores con parámetros productivos y reproductivos, perfiles endocrinos y metabólicos en sistemas de producción basados en pastoreo controlado, se observó que la producción de leche corregida por grasa al 4% (LCG) fue mayor en vacas multíparas con el genotipo LL al inicio de la lactancia. En el presente trabajo observamos una clara predominancia del alelo L en todos los rodeos estudiados, si bien existen diferencias entre los tambos. La frecuencia del alelo L en el tambo 4, se aproxima a los resultados obtenidos en rodeos lecheros norteamericanos (0,92, Lucy y col., 1993) y húngaros (0,89, Balogh y col., 2009). Como este tambo utiliza semen congelado de origen norteamericano y canadiense, es esperable que la frecuencia de dicho alelo se asemeje a la reportada en dichos rodeos. La frecuencia de este alelo encontrada en los tambos 1 y 2 se asemeja más a la encontrada en rodeos de Australia, Japón y Alemania (0,80, Shariflou y col., 2000). Shariflou y col. (2000) compararon las frecuencias alélicas en diferentes razas de distintos países y argumentaron que la fuerte selección a favor de la producción lechera en rodeos norteamericanos ha provocado una selección indirecta a favor del alelo L y por lo tanto el aumento de su frecuencia, sin embargo nuestros resultados muestran que las poblaciones estudiadas están en equilibrio HW para este gen. Por otro lado, en el tambo 2 se utiliza exclusivamente semen congelado de origen neocelandés, lo que explicaría la menor frecuencia del alelo L en este tambo en comparación con el 4. Esto refleja las diferencias en los objetivos de selección lechera entre estos dos países, Estados Unidos vs. Nueva Zelanda (Harris y Kolver, 2001; Shook, 2006). Estos comentarios estarían apoyados por los índices FST que reflejan una mayor divergencia genética entre el tambo 4 y las otras poblaciones. En ningún caso estos factores afectan las frecuencias alélicas y genotípicas lo suficiente como para causar desvíos de lo esperado según la hipótesis de equilibrio Hardy-Weinberg.

En el caso del gen IGF-I se observó una distribución más similar de la frecuencia de los alelos A y B siendo, en todos los casos, A de mayor frecuencia que B (Cuadro 2). El genotipo más frecuente fue el heterocigoto AB seguido del AA y por último el BB, no difiriendo sus frecuencias entre tambos (P = 0,562). Las frecuencias halladas en este trabajo concuerdan tanto con las reportadas recientemente por nuestro grupo (alelos A y B: 0.59 y 0.41; genotipos AA, AB y BB: 0.31, 0.54 y 0.14, respectivamente) en otras poblaciones Holando de nuestro país (Nicolini y col., 2013), como con las descritas en la literatura (0,55, 0,56 y 0,52 para el alelo A y 0,45, 0,44 y 0,48 para el alelo B) en rodeos Holando estadounidenses (Hines y col., 1998; Li y col., 2004) y polacos (Siadkowska y col., 2006), respectivamente. Se observaron valores medios de heterocigosidad con valores observados y esperados similares, excepto para el tambo 3 (Cuadro 3). En este tambo existió una diferencia notoria entre los valores de heterocigosidad observados y esperados, lo que se refleja en el índice FIS para ese rodeo (Cuadro 5), con un valor medio y positivo, indicando un déficit de heterocigotos en esta población. Sin embargo, este déficit no generó desviaciones de lo esperado para el equilibrio Hardy-Weinberg (Cuadro 4). En los otros tres tambos (1, 2 y 4), los índices FIS también son medios para este gen, pero negativos, indicando una tendencia hacia el exceso de heterocigotos, aunque esto tampoco determina desvíos de lo esperado bajo una situación de equilibrio génico (Cuadro 4). Los valores de FST son cercanos a cero, reflejando la alta similitud observada entre las poblaciones muestreadas (Cuadro 5). Los reportes de la asociación del genotipo IGF-I con producción de leche son escasos y no concluyentes. Siadkowska y col. (2006) argumentan a favor del genotipo AB que tendió a ser superior a los genotipos AA y BB en producción de LCG y de sólidos totales, mientras que Hines y col. (1998) y Mullen y col. (2011) no encontraron asociaciones entre este polimorfismo y variables productivas. En un estudio previo de nuestro grupo de investigación realizado en los 2 tambos 1 y 2 analizados en el presente trabajo (Ruprechter y col., 2011) se encontró una tendencia (P = 0,09) a mayor producción de LCG en vacas del genotipo AB respecto a las de genotipo AA en promedio durante toda la lactancia y respecto a las de genotipo BB en lactancia media (120 días de lactancia). Asimismo, en dicho trabajo también encontramos una asociación entre SnabI-IGF-I y el intervalo parto-primer servicio, siendo las vacas portadoras del genotipo AB las del menor intervalo en relación a las del genotipo BB. Estos hallazgos, sumados a los resultados reportados por nuestro grupo en otras poblaciones Holando de nuestro país (Nicolini y col., 2013), que indican que vacas con genotipo AA reinician antes la ciclicidad posparto, sostienen la importancia del gen IGF-I en producción y reproducción en vacas lecheras.

El número de individuos de acuerdo a las combinaciones alélicas de los dos marcadores moleculares presentes en cada tambo se detalla en el Cuadro 6.

Cuadro 6. Número de animales para cada combinación posible de los genotipos de los genes GH (LL, LV y VV) e IGF-I (AA, AB y BB) en tres tambos

Población

LL

LV

VV

1

AA

32

5

0

AB

30

23

1

BB

11

3

0

2

AA

17

4

0

AB

23

14

0

BB

9

0

1

4

AA

19

1

0

AB

36

5

0

BB

11

2

0

Debido a la escasa (tambos 1 y 2) o nula (tambo 4) frecuencia de homocigotas VV en las distintas poblaciones, se observa la ausencia de los individuos VVAA y VVBB en el tambo 1, y de los individuos VVAA, VVAB y LVBB en el tambo 2. El estudio de la frecuencia de combinaciones genotípicas no indicó evidencia de la existencia de desequilibrio gamético entre los alelos de ambos loci (D`= 0,322, LOD = 1,12, r2 = 0,027), es decir, no se puede afirmar que estas combinaciones alélicas son heredadas en forma dependiente o no.

Aparte del presente trabajo y otro estudio reciente de nuestro grupo (Nicolini y col., 2013), no hemos encontrado reportes del estudio de estos polimorfismos en vacas Holando en Uruguay. Sí existen reportes de caracterización génica de la raza Holando Uruguayo utilizando los grupos sanguíneos como marcadores moleculares (Kelly y col., 2002). En dicho trabajo se concluyó que existiría una disminución de la variabilidad génica en la siguiente generación y una gran similitud entre las poblaciones de Holstein Norteamericano y Holando Uruguayo. En el presente estudio los índices FIS fueron en general bajos a moderados en las distintas poblaciones, no registrándose una deficiencia de heterocigotos, excepto en el caso del tambo 3 para IGF-I. Por otra parte, para el gen GH la elevada frecuencia del alelo L y del genotipo LL indicarían pérdida de diversidad genética para este marcador. Los valores de FST globales son muy cercanos a cero argumentando a favor de la similitud génica entre las poblaciones, siendo el tambo 4 el más divergente de todos debido probablemente al origen del semen y al menor número de padres utilizados. La población del tambo 4 tendería a ser más semejante a la población norteamericana, estando de acuerdo con lo reportado por Shariflou y col. (2000) y Kelly y col. (2002), tendencia lógica teniendo en cuenta el origen del semen utilizado en este tambo.

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Conclusión

De los resultados obtenidos se desprende que la casi fijación del alelo L del polimorfismo AluI (GH) en los cuatro tambos estudiados, limitaría el espacio para su utilización en estudios de asociación con miras a aplicarlo como marcador en un posible programa de selección asistida. En el caso del marcador SnabI (IGF-I), dadas las frecuencias génicas y genotípicas obtenidas en el presente trabajo, sería posible realizar estudios de asociación con parámetros de interés productivo en las poblaciones analizadas.

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Agradecimientos

El presente estudio recibió la financiación del Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria (INIA FPTA 214).

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Bibliografía

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