Último Número: 207 Julio-Setiembre 2017

Técnico: Primera aplicación terapéutica en Uruguay de células estromales mesenquimales en un canino con no-unión ósea femoral

Technical: First regenerative treatment in Uruguay with mesenchymal stromal cells of a non-union femoral bone defect in a canine


Autor: Semiglia G1, Filomeno A1, Yaneselli K2, Díaz H2, Zunino J3, Benavides U2, Maisonnave J*2

1 Departamento de Pequeños Animales-Perfil Quirúrgico, Facultad de Veterinaria, Universidad de la República, Lasplaces 1620, Montevideo, Uruguay

2 Área de Inmunología, Departamento de Ciencias Microbiológicas, Facultad de Veterinaria, Universidad de la República, Lasplaces 1620, Montevideo, Uruguay.

3 Banco de Tejidos, INDT, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

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Recibido: 15/7/2014 Aceptado: 3/11/2014


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Introducción | Materiales y Métodos | Resultados | Discusión | Conclusión | Bibliografía

 

Resumen

La no-unión es una patología de la reparación, en la que las condiciones de regeneración ósea normales, se encuentran alteradas. El objetivo del presente estudio fue evaluar el tratamiento alternativo de una no-unión ósea de fémur en un canino de 3 años de edad, raza Poodle, con células estromales mesenquimales (CEM) derivadas de médula ósea (MO). Luego del tratamiento inicial convencional (cirugía y fijación externa) de una fractura de fémur que no evolucionó favorablemente a la consolidación, se recurrió a una técnica de regeneración tisular estimulada por la aplicación percutánea en el foco de no-unión, de CEM-MO autólogas. La evaluación del paciente se realizó clínica y radiológicamente cada 15 días, hasta los 2 meses post tratamiento con CEM-MO. La terapia celular indujo regeneración ósea ya a partir de las 2 semanas post-aplicación de las células. A las 8 semanas la terapia celular aplicada en la no-unión, permitió la consolidación ósea y por consiguiente, la recuperación funcional del miembro. Nuevas investigaciones deben ser realizadas para evaluar la aplicación de CEM como terapia alternativa en casos de no-unión para mejorar y acelerar los procesos regenerativos en lesiones óseas.

Palabras clave: terapia celular, no-unión, células estromales mesenquimales, canino


Summary

Non-union is a pathologic bone repair process, where normal conditions of osseous regeneration are altered. The objective of the present study was to assess the alternative treatment of a femoral non-union fracture in a 3 year old male Poodle dog, using bone marrow mesenchymal stromal cells (BM-MSC). After a former conventional surgical treatment of the femoral fracture (open reduction plus external fixation), a non-union was established after two months post-surgery. Thus, a tissue regenerative technique was essayed: percutaneous injection of autologous BM-MSCs at the non-union site. The patient was clinically and radiologically evaluated every 15 days up to 2 months. Observed results seem to demonstrate that the cellular therapy induced bone regeneration starting, two weeks post regenerative treatment. At 8 weeks, clinical and radiological improvement was observed. Cell therapy applied to the femoral non-union enabled bone healing, thus allowing the patient to regain its limb’s function. Further studies are needed to evaluate the application of BM-MSC as an alternative therapy in osseous non-union cases, in order to improve and accelerate the regenerative process in bone lesions.

Keywords: cellular therapy, non-union, BM - MSC, canine


Introducción

El tejido óseo es uno de los pocos tejidos del organismo que cuando ocurre una fractura es capaz de regenerarse totalmente, si se hallan presentes los componentes biológicos y mecánicos apropiados. Sin embargo, existe la no-unión ósea, la cual es una fractura en la que la progresión de la cicatrización aparentemente ha cesado, hay movimiento en el sitio y la curación es improbable sin intervención. Existen diversas causas como estabilidad inadecuada de la fractura, mala reducción o aposición de la fractura, inadecuada irrigación, infección o fragmento óseo faltante (Millis y Jackson, 2006; Schulz, 2009).

En caninos, el tratamiento tradicional consiste en utilizar un implante óseo autólogo o en el peor de los casos la amputación del miembro (Millis y Jackson, 2006; Schulz, 2009). Sin embargo, para utilizar un implante óseo autólogo, la extracción de hueso esponjoso posee un riesgo sobre el paciente y la cantidad de hueso que se puede extraer es limitada (Henrich Younger y Chapman, 1989; Yoo y col., 2005; Yu y col., 2013). Para evitar los riesgos de extracción de un implante autólogo, se han desarrollado otras metodologías tales como implantes alogénicos (Barckman y col., 2013; da Silva Filho y col., 2013) o xenogénicos (Semiglia y col., 2006).

La medicina regenerativa en veterinaria es un campo emergente, conocido también como “Ingeniería de Tejidos”. El objetivo de esta disciplina es obtener tejidos vivos que puedan reemplazar estructuras perdidas y contribuir al retorno funcional. Consiste en estimular o suministrar células, factores de crecimiento, tejido vivo funcional mediante un soporte (natural, sintético o mezcla de ambos), para promover la regeneración del tejido original y conseguir volver a la estructura funcional normal. En medicina ortopédica se han utilizado células madre mesenquimales (CMM) para promover la regeneración ósea en caninos, tanto con la aplicación de células autólogas (Bruder y col., 1998), como alogénicas (Arinzeh y col., 2003; Yaneselli y col., 2013).

Friedenstein y col. (1968) fueron los primeros en describir que en la médula ósea existen células estromales mesenquimales (CEM) multipotentes, lo que les permite diferenciarse in vitro en diversos linajes celulares, el trilinaje característico es: adiposo, cartilaginoso y óseo (Jung y col., 2008), cuando se comprueba dicho potencial en conjunto a otras características son denominadas CMM (Horwitz y col., 2005). Las CMM poseen tres características relevantes para su aplicación terapéutica: promover la angiogénesis (Imanishi y col., 2008), poseer multipotencialidad (Vieira y col., 2010) y ser inmunomoduladoras (Carrade y Borjesson, 2013). Estas características las convierten en una alternativa atractiva para ser utilizadas como terapia celular en medicina veterinaria (de Bakker y col., 2014; Volk y Theoret, 2013; Jung y col., 2008; Yaneselli y col., 2013). Sin embargo, de la población celular de la médula ósea aproximadamente 1 en 25,000 hasta 1 en 100,000 son CMM (Banfi y col., 2001; Muschler y col., 2001; Strem y col., 2005), por lo tanto, es necesario expandir in vitro (aislamiento, expansión, criopreservación) para aumentar su número original y obtener una mayor cantidad de células para su aplicación terapéutica (Jung y col., 2008; Volk y col., 2012; Yamada y col., 2004).

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el tratamiento alternativo de una no-unión ósea de fémur en un canino, con células estromales mesenquimales autólogas derivadas de médula ósea (CEM-MO).

 

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Materiales y Métodos

Paciente

Un canino macho de 3 años de edad, raza Poodle, con fractura expuesta de fémur derecho (Figura 1A) fue atendido en el Hospital Veterinario, Facultad de Veterinaria, Universidad de la República. Se realizó el tratamiento tradicional con fijación externa (Figura 1B). A las 8 semanas posteriores al tratamiento tradicional, fijación, fue evaluado clínicamente, no existiendo una evolución positiva, rechazando el apoyo con una claudicación de grado 10, según una matriz con una escala de puntuación del 0 al 10 (la numeración aumenta a medida que el grado de claudicación es más severo), apoyo normal = 0, rechaza al comenzar el apoyo = 1, del 2 a 8 existe mayor grado de rechazo al apoyo, apoya cuando está de pie, pero lo rechaza cuando está en movimiento=9 y no soportan peso en absoluto sobre el miembro = 10, descrito por Summer y Smith (1988), confirmándose radiológicamente una no-unión de fémur. En el foco de fractura no existían evidencias de regeneración ósea ni de osteomelitis (Figura 1C).

Figura 1: A Radiografía lateral de la fractura del fémur pre tratamiento tradicional

Figura 1B Fijación externa del miembro posterior derecho.

Figura 1C Radiografía lateral de fémur: se aprecia no-unión crónica 2 meses post-fijación externa.

Aislamiento, expansión y criopreservación de las CEM-MO

El protocolo de extracción de médula ósea y la aplicación de las CEM-MO fue previamente autorizado por la Comisión Honoraria de Experimentación Animal (CHEA), UdelaR. El protocolo de aislamiento de CEM-MO utilizado fue adaptado del descrito por Jung y col. (2008), brevemente fue aspirada, con una aguja medular de Hamchidi® conteniendo 5000 IU/mL heparina (0,1mL), 7 mL de médula ósea (MO) proveniente del húmero derecho del paciente. Este procedimiento se realizó en forma percutánea bajo sedación (acepromacina 1% (0,01 mg/kg), midazolam 0,5% (0,25 mg/kg) y ketamina 5% (5mg/kg) en forma I/V. Como analgesia se utilizó Tramadol (2 mg/kg). Se aplicó en forma profiláctica Penicilina-Streptomicina S/C. La MO se colocó sobre un colchón de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare), se centrifugó a 400 G durante 20 minutos y se colectó la capa flogística y se sembró a una densidad de 4x105 células / cm2 en una botella de cultivo de 75 cm2. El medio de crecimiento utilizado fue Minimal Essential Medium (MEM), 15% suero fetal bovino (SFB) y 100 mg/mL gentamicina e incubado a 37 °C + 5% CO2. A las 48 horas se cambió el medio de crecimiento para remover las células no adherentes. Se controlaron las características morfológicas y de adherencia al plástico de los cultivos celulares. Al llegar al 80-90% de confluencia, las células se levantaron utilizando 0,25% Tripsina/EDTA y se expandieron 1:3, de cada pase se criopreservaron 1x106 CEM-MO. La criopreservación se realizó en un medio de congelación con 50% MEM, 40% SFB, 10% dimetilsulfóxido (DMSO) y las células se mantuvieron en N2 líquido (-196 °C), hasta su utilización.

 

Terapia celular con CEM-MO autólogas

Con la misma sedación mencionada anteriormente, fueron implantadas 1x106 CEM-MO autólogas en pase 4, de forma percutánea sobre el sitio de no-unión (detectado por palpación) (Figura 2).

 

 

Figura 2: Aplicación percutánea de CEM-MO en la no-unión.

Evaluación clínica y radiológica

Fue evaluada la claudicación del paciente según la escala de puntuación descrita por Summer y Smith, (1988). Fueron realizadas evaluaciones clínicas y radiológicas cada 15 días post-implante de CEM-MO, hasta las 8 semanas. La evaluación clínica consistió en detectar signos de inflamación local y sistémica. Los signos de inflamación local estudiados fueron: rubor, calor, dolor y edema. Los signos de inflamación sistémica evaluados fueron: temperatura corporal, frecuencia cardiaca y respiratoria, color de mucosas, piel y estado de los nódulos linfáticos regionales.

 

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Resultados

Las CEM-MO destinadas a la terapia tenían una morfología fibroblástica y eran adherentes al plástico. Comienzaron a evidenciarse signos radiológicos de regeneración ósea en el foco de fractura a partir de las 2 semanas posteriores al implante. A las 8 semanas post tratamiento regenerativo se observó un aumento de la densidad ósea, progresando la radio-opacidad (figura 3).

Figura 3. Evolución radiológica de la no-unión: Radiografía lateral de fémur 8 semanas post-terapia celular: se aprecia una zona más radiodensa en la zona de no-unión, indica comienzo de actividad de osteogénesis.

 

La evolución radiológica fue acompañada de una evolución clínica con retorno gradual al apoyo en el mismo lapso y el paciente fue capaz de caminar apoyando el miembro continuamente con una claudicación de 1 en la escala de Summer y Smith, (1988).

 

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Discusión

Una no-unión se produce cuando el proceso de regeneración ósea aparentemente ha cesado, hay movimiento en el sitio y la curación es improbable sin intervención (Millis y Jackson, 2006). En el presente caso clínico, el paciente presentaba una no-unión de resolución inviable, bordes sin vascularización, no llenándose completamente la brecha, con bordes redondeados y sin aparente desencadenamiento del proceso osteogénico (Millis y Jackson, 2006).

Los tratamientos tradicionales consisten en desbridar los bordes para favorecer la vascularización y utilizar un injerto óseo autólogo (Schwartz y col. 2009) o heterólogo. Este tratamiento exige una maniobra cruenta para extraer el autoimplante de hueso esponjoso o en caso de implantes heterólogos el riesgo del rechazo (Bennett y Rizzolo, 1998; Henrich Younger y Chapman, 1989). Se han utilizado implantes de hueso heterólogo bovino desantigenizado, debido a que con el mismo se evita el rechazo al xenoinjerto y una intervención quirúrgica adicional, que requiere el implante autólogo (Semiglia y col. 2006).

En el presente caso, post- tratamiento tradicional, fractura fijada, no existieron evidencias de comienzo de procesos de osteogénesis en los bordes, 8 semanas post-fijación.

La aplicación de CEM-MO con características de célula madre tiene varias ventajas comparada con los tratamientos tradicionales, debido a que las mismas poseen potente efecto inmunomodulador, así como angiogénesis y osteopro-génesis (Carrade y Borjesson, 2013). Además, la terapia celular requiere de una leve sedación y su aplicación puede ser percutánea, que evita el procedimiento quirúrgico tradicional de colocar un implante y utilizar anestesia general, lo que implica un riesgo para el paciente.

The International Society of Cellular Therapy (ISCT) determinó que, para denominar a unas CEM de CMM, tiene que tratarse de una fracción celular del estroma que posea características de ser adherentes al plástico, expandidas en cultivos celulares, tener morfología tipo fibroblástica, además de comprobar otras características como la diferenciación in vitro en tri-linaje (adiposo, cartilaginosos y óseo) y realizar el inmuno-fenotipaje (Horwitz y col., 2005). Sin embargo, en CMM de especies domésticas no tiene tanta importancia el inmunotipificaje de las células por la escasez o ausencia de marcadores específicos de especie (Horwitz y col., 2005; Requicha y col, 2012).

En el presente trabajo utilizamos la nomenclatura de CEM para las células utilizadas, dado que sólo se comprobó que eran adherentes al plástico y que tenían morfología fibroblástica. No fueron caracterizadas por citometría de flujo, ni comprobada su multi-diferenciación. A pesar de esto, el método de aislamiento de las CEM-MO utilizado y las características de las células obtenidas de poseer morfología tipo fibroblástica y adherencia al plástico, concuerdan con los resultados obtenidos por otros autores (Bruder y col., 1998; Jung y col., 2008; Martin y col., 2003), que sí caracterizaron las células implantadas. En nuestro trabajo existió una evolución positiva del paciente con evidencias radiológicas y clínicas, comparando las imágenes correspondientes al inicio de la terapia celular y las de la semana 8 post-tratamiento de CEM sin andamio, donde se evidenciaron los bordes óseos del defecto y radio-opacidad, indicando que comenzaban los procesos de regeneración ósea con una reactivación del proceso regenerativo óseo. Nuestros resultados indican una consolidación acelerada a las 8 semanas, y concuerdan con lo descrito por Bruder y col, (1998) que en caninos con defectos de no-unión utilizaron CMM-MO autólogas y alogénicas (Arinzhe y col., 2003). Las células fueron asociadas a un andamio de cerámica que tiene propiedades osteo-conductoras (su composición es en su mayoría de calcio), y observó a las 8 semanas apariencia radio-opaca indicando la mineralización del tejido.

Resultados similares a los obtenidos en el presente reporte se obtuvieron en Uruguay con terapia celular con CMM alogénicas, Yaneselli y col. (2013), donde se aplicaron 10x106 CMM derivadas de tejido adiposo alogénicas, sobre una no-unión de radio asociada a un proceso de osteomielitis, en un canino adulto. Como resultado el paciente volvió utilizar el miembro afectado 16 semanas post-tratamiento y radiológicamente fue evidenciada la resolución del proceso de osteomielitis, comenzando los procesos de osteogénesis y no evidenciándose rechazo al aloimplante.

Los reportes que describen el uso de CMM como terapia alternativa a patologías óseas crónicas son escasos. En humanos fue tratada con éxito la osteonecrosis de la cabeza del fémur con la aplicación local de CMM-MO sobre el sitio necrosado, cabeza de fémur (Handschel y Meyer 2011; Kikuiri y col., 2010); este trabajo coincide con la metodología empleada en el presente trabajo, aplicación de las células directamente en el sitio afectado. Los resultados obtenidos por (Gangji y col., 2011; Zhao y col., 2012) fueron reducción en los síntomas, reversión de la osteonecrosis y no existió reacción adversa. Estos tratamientos coinciden con los resultados obtenidos en el presente caso, donde hubo una evolución clínica positiva del paciente y promoción de la osteogénesis.

A pesar de las diferencias de tratamiento en cuanto a cantidad de células y el tipo de patologías óseas crónicas tratadas, existe un punto de convergencia en los resultados de los distintos trabajos planteados donde el efecto de las CEM y las CMM promueven la recuperación del paciente obteniendo una evolución positiva del paciente con evidencias radiológicas y clínicas. Ello se atribuye a que las células utilizadas poseen características de inmunomodulación, angiogénesis y osteoprogenitoras. (Yaneselli y col., 2013; Kikuiri y col., 2010; Zhao y col., 2012). Esto coincide con los resultados del presente trabajo donde existió una recuperación favorable del paciente.

En el presente tratamiento, hasta las 8 semanas post-tratamiento, no existieron evidencias de reacciones adversas (no hubo respuesta inflamatoria local o sistémica) en el paciente, coincidiendo con los resultados de otros autores (Arinzeh y col., 2003; Bruder y col., 1998; Jung y col., 2008; Yamada y col., 2004), que utilizaron en caninos implantes de CEM-MO caracterizadas como CMM, y demostraron que las CMM alogénicas tampoco provocaron una reacción inmune adversa al no detectar anticuerpos contra las células alogénicas implantadas.

 

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Conclusiones

La terapia celular con CEM-MO aplicada sobre la no-unión contribuyó a la consolidación ósea y el retorno funcional del miembro. Nuevas investigaciones deben ser realizadas para evaluar la aplicación de CEM como terapia alternativa en casos crónicos de no-unión ósea para mejorar y acelerar los procesos regenerativos óseos.

 

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